仕事が出来る人の リクエストすみません また新たに疑問が

仕事が出来る人の リクエストすみません また新たに疑問が。お疲れ様です。リクエストすみません また新たに疑問が出てきてしまったので、よろしければ回答していただけたら嬉しいです

ご指摘されたことをしっかり確認して、形質転換までやってみたのですが、やはりコロニーが生えませんでした

また、処理前のプラスミドも一緒に形質転換したんですが、コロニーが数個しか生えませんでした 処理前のプラスミドは、どこかから取り寄せたもので、(詳細についてはわかりません)コンピテントセル30ulに対して1ul加えています

これらのことから、形質転換効率がとても悪いことが考えられると思います

形質転換効率が悪いと、ライゲーションが上手くいってもコロニーが生えてくれないのではないかと

まずはこの形質転換効率の悪さをなんとかしないと、上手くいかない原因が特定できないのではないかな と思いました

形質転換効率が悪い理由をいくつか考えてみたんですが、

①形質転換のやり方が悪い
②コンピテントセルが悪い

①については、
?凍結してあったコンピテントセルを室温で解凍した
?コンピテントセルとプラスミドを混ぜる際、ピペッティングしていたので大腸菌が死んだ
?ヒートショックを45秒したが、時間が長すぎて大腸菌が死んだ

また、形質転換後の培養液を抗生物質を添加していないLB培地に撒いてみたのですが、めちゃくちゃ生えてきました このことから、大腸菌が死んでるわけではないのかな と思います

つまり、プラスミドが大腸菌に上手く入ってくれていないのではないのかと
たくさんプラスミドを取り込んでもらうにはどうしたらいいのでしょうか

また、形質転換でここは気を付けたほうがいいというポイントはありますか 自分で盲点となっている事があるかもしれません (本当は教員に聞くべきことなのでしょうが、教員はお前が下手なだけの1点張りなのでどうしようもありません )

②については、自作のコンピテントセルを使っています

博士課程の人にもらったプロトコルを、教員が手直しして、それを用いてます
それで、作るときにODを測らずにやっていました 教員が目視で培養具合を確認して、OKだったらコンピテントセル作成に取り掛かるといった感じです

コンピテントセル作成の際、ODが増えすぎると良くないのでしょうか 調べてみても、OD600が0 9を超えてはいけないとは書かれていますが理由がわかりません

また、コンピテントセル作成の際にほかにも気を付けたほうがいいことはあるでしょうか

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「仕事が出来る人」の。ネイティブがビジネスでよく使う英語フレーズを英会話例文付きでご紹介します
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度々すみませんって英語でなんて言うの。これに似た表現として最後の例もまた ” ” と謝る言葉から入り。〝
” たくさんの質問「」は質問された質問の量
を強調したり誇張したりしますが。このような文章では専門的であり。すべての
詳細を知りたいと受け手に伝えます。質問ばかりしていると相手の時間を取っ
てしまっているわけなので申し訳ない気持ちになるかもしれませんね。何度もすみませんを英語で。何度も同じミスをしてしまった時に友人同士ならどのように言えばいいでしょ
うか? ここではカジュアルな場面で使える何度もすみませんを表すフレーズを
紹介します。 また私! &#; ! とは直訳してやぁ。また僕
だけど。帰りにトマトつ買ってきてくれないかい?

「私は多くの依頼をしてすみません。を英語で訳すと 今なら。「毎日レッスン
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多くの依頼をしてすみません。私は多くの人に迷惑を掛けてしまった。

お疲れ様です。そうですか、生えなかったのは残念です。処理前のプラスミドをコントロールに立てたのはとても良いですね。形質転換の効率という問題点を浮き彫りにできたのは質問者様の良い成果だと思います!!まず、一応ですが薬剤耐性がプレートとプラスミドで合っているかを確認してください。オリジナルのプラスミドマップしかないと、たまーに間違いが書いてあるということはありますほんらいあってはなりませんが。回答します。①形質転換のやり方- 解凍は室温で良いですが、温度が上がると一気に形質転換効率が下がるので、解け始めたら「やさしく」タッピングし、溶け切ったらすぐに氷上に置くと良いでしょう。- ピペッティングは良くないかもしれません。コンピは脆いので、混ぜる時は優しいタッピングがいいでしょう。その後氷上に静置します10-30min- ヒートショック45秒は適正です。しかし、その後はすぐに氷水氷だけだとチューブが冷えにくいに突っ込んで一気に温度を下げないと死にます。抗生物質なしのLBプレートに関しては、大腸菌が全滅していないことはわかりますがどの程度死んでいるかはわからないかもしれませんそれを試してみたこと自体は良いアイディアだともいます![気をつけるポイント]1.当たり前かもしれませんが、コンピは作成時に一度凍結したものを多くとも100ul程度で分注して-80度で保存します。融解したものは再凍結してはいけません再凍結はかなり形質転換効率を下げます。また、100ul以上分注すると解凍時に溶けづらく、これもまた効率を下げます。2.上記しましたが、コンピは物理的に脆いです。タッピングも優しく行います。ボルテックスなどはもってのほかです。3.ヒートショックしたコンピは、その後200ul程度のSOC培地で37度, 45分程度、培養round tubeに移すしていますか?これはとても重要なステップです。プレートは大腸菌にとって液体培養よりもキツイ場所です。SOCで浸透することで、弱った大腸菌を回復させます。とくにプラスミドが上手く入った大腸菌は基本的に異物を食らっていて弱っているので、必須となります。4.プレートは事前によく温めて置くことです。5.プラスミドが入った大腸菌は増えづらいです。通常18時間程度もすれば大きなコロニーになりますが、プラスミドによっては30時間程度置かないとピックアップできるような大きさのコロニーが得られない場合もあります。②に関しては、正直危ないと感じました。コンピ作成を学部生が個人でやっているのですか?通常、コンピは非常に重要だし全員が使うので、修士以上が監修しながら全員が使うストックを作るのが一般的かと思います。そうすれば、異常が出た時に学生同士で比較しやすい全員がうまくいかないならコンピが原因とすぐわかるですし。コンピ作成が初めてなら、質問者様が懸念することは起こり得ます。まず、他のプラスミドの形質転換効率も悪いのかを確認しましょう。質問者様のプロトコルで、精製したプラスミドならば、本来ヒートショックをしなくてもプレートにびっしりとコロニーが生えるはずです。そうでなければコンピが確実に悪いですね。ODの制限に関しては、対数増殖期、つまり元気に増えている健康な状態の大腸菌でコンピ作りましょうということです。私はOD600が0.5-0.6で作ります。目視でもわかりますが、一応はかって確認します。0.9は確かに多くて、大腸菌が互いに増殖を阻害する物質を出し始めるので、この状態でコンピを作ると復帰が弱くなる=プラスミドが導入されると死ぬものが多くなると言われています。しかし、この点はそこまで劇的には効率を下げたりしません。どちらかというとその後の処理が効率には影響しますね。コンピの作成プロトコルによりますが、とにかく手早くやることが重要です。大腸菌に傷をつけているのだと自覚して、もたつかずに作業を終わらせます。また凍結も、液体窒素に入れてから-80度に移動するまでを手早くやります。プロトコルを教えてくれたら、直した方がいいところなどお教えできるかもしれません。

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